La genómica comparada revela una amplia variación genómica entre poblaciones de especies de Listeria en condiciones naturales y alimentarias.

Comunicaciones ISME volumen 3, Número de artículo: 85 (2023) Citar este artículo

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Comprender la variación genómica bacteriana vinculada a distintos entornos puede generar conocimientos novedosos sobre los mecanismos subyacentes a la adaptación diferencial y la transmisión de microbios entre entornos. Obtener estos conocimientos es particularmente crucial para los patógenos, ya que beneficia la vigilancia de la salud pública. Sin embargo, la comprensión de la variación genómica bacteriana está limitada por la escasez de investigaciones sobre la variación genómica junto con diferentes contextos ecológicos. Para abordar esta limitación, nos centramos en Listeria, un género bacteriano importante para la seguridad alimentaria que incluye el patógeno humano L. monocytogenes, y analizamos un conjunto de datos genómicos a gran escala recopilados por nosotros de entornos naturales y asociados con alimentos en todo Estados Unidos. A través de análisis genómicos comparativos de 449 aislados del suelo y 390 aislados de agua agrícola e instalaciones de procesamiento de productos agrícolas que representan L. monocytogenes, L. seeligeri, L. innocua y L. welshimeri, encontramos que los perfiles genómicos difieren fuertemente según los entornos dentro de cada uno. especies. Esto está respaldado por los subclados asociados al medio ambiente y la presencia diferencial de plásmidos, islas de estrés y genes accesorios involucrados en la biogénesis de la envoltura celular y el transporte y metabolismo de los carbohidratos. Los genomas centrales de las especies de Listeria también están fuertemente asociados con el entorno y pueden predecir con precisión las fuentes de aislamiento a nivel de linaje en L. monocytogenes mediante el aprendizaje automático. Descubrimos que la gran variación genómica asociada al medio ambiente en Listeria parece estar impulsada conjuntamente por la propiedad del suelo, el clima, el uso de la tierra y las especies bacterianas que la acompañan, que representan principalmente actinobacterias y proteobacterias. En conjunto, nuestros datos sugieren que las poblaciones de especies de Listeria se han adaptado genéticamente a diferentes ambientes, lo que puede limitar su transmisión de ambientes naturales a ambientes asociados a alimentos.

Los genomas bacterianos, incluidos tanto los genomas centrales (genes presentes en todos los individuos) como los genomas accesorios (genes que no comparten todos los individuos), pueden ser muy versátiles dentro de las especies debido a la ganancia y pérdida de genes y a la recombinación homóloga mediada por la selección y dispersión ambiental [1, 2,3,4]. Esta variación genómica permite que las especies bacterianas (en su mayoría bacterias no patógenas) vivan en una amplia gama de dimensiones ecológicas, incluidas condiciones ambientales con diferentes fuentes de carbono y nutrientes inorgánicos [5]. Si bien algunos patógenos humanos (p. ej., Bacillus anthracis, Clostridium spp., Listeria monocytogenes, Yersinia pestis, Burkholderia pseudomallei y Francisella tularensis) también pueden sobrevivir en entornos naturales [6], nuestra comprensión de su variación genómica en diferentes entornos es limitada debido a una falta de investigaciones intensivas en entornos naturales en comparación con entornos asociados a los humanos [7,8,9]. Esta es una oportunidad perdida para mejorar la comprensión de los mecanismos ecológicos que subyacen a la adaptación de los patógenos a entornos no humanos y para informar mejor la vigilancia de la salud pública de enfermedades infecciosas, como por ejemplo inferir la probabilidad de que las cepas se transmitan desde entornos naturales a entornos asociados con los humanos. .

Listeria, un género bacteriano Gram positivo, anaeróbico facultativo y que no forma esporas, vital para la seguridad alimentaria, ofrece una oportunidad para estudiar la variación genómica entre entornos naturales y humanos en bacterias importantes para la salud pública. Los miembros de Listeria están ampliamente distribuidos en entornos naturales, así como en suelos agrícolas, agua e instalaciones de procesamiento de alimentos [10,11,12]. Dos especies de Listeria—L. monocytogenes y L. ivanovii—se consideran patógenos facultativos. Si bien otras especies no son patógenas [13], estas especies (p. ej., L. seeligeri, L. innocua y L. welshimeri) a menudo se prueban en la industria alimentaria porque se consideran evidencia de condiciones que pueden facilitar la contaminación por L. monocytogenes. [14, 15]. Por lo tanto, el estudio de la variación genómica de las especies de Listeria puede proporcionar información sobre su transmisión desde ambientes naturales a ambientes y alimentos asociados a los alimentos, lo cual es particularmente importante para productos alimenticios como los productos frescos, donde se utilizan pasos sin matar para inactivar patógenos que serían introducidos en cualquier punto de la cadena alimentaria.

Los ambientes asociados a los alimentos normalmente tienen una amplia gama de factores estresantes presentes, que incluyen pH bajo, baja actividad del agua, baja temperatura, alta salinidad, desinfectantes (p. ej., amonio cuaternario) y compuestos antimicrobianos (p. ej., nisina) [16]. Las especies de Listeria, incluida L. monocytogenes, han desarrollado diversos mecanismos de respuesta al estrés, incluido un regulón de respuesta al estrés general dependiente de σB y dos islotes de supervivencia al estrés (SSI-1 y SSI-2), que facilitan el crecimiento a pH bajo y altas concentraciones de sal ( SSI-1), así como el crecimiento a pH alto y en condiciones oxidativas (SSI-2) [17, 18]. En la naturaleza, Listeria vive un estilo de vida saprotrófico y desempeña un papel vital en la descomposición y el ciclo de nutrientes en un ecosistema [19]. En comparación con los entornos asociados a los alimentos, los entornos naturales proporcionan a las bacterias condiciones relativamente favorables y estables con alteraciones moderadas en las propiedades fisicoquímicas [20, 21]. Sin embargo, se desconoce en gran medida cómo las especies de Listeria se adaptan y transmiten de manera diferencial a través de estos dos tipos de ambientes.

Aquí, aprovechamos los datos genómicos de 449 aislados de Listeria que obtuvimos de una reciente recolección de suelo a gran escala en los Estados Unidos [22] y secuenciamos genomas adicionales de 390 aislados de Listeria obtenidos de diferentes entornos asociados con alimentos, incluido (i) agua agrícola [ 23, 24] y (ii) instalaciones de procesamiento de productos [25, 26]. Estos aislados representan el patógeno transmitido por los alimentos L. monocytogenes y tres especies no patógenas comunes (L. seeligeri, L. innocua y L. welshimeri). A través de análisis genómicos comparativos en profundidad, identificamos fuertes asociaciones en filogenia, genomas centrales y accesorios, plásmidos e islotes de supervivencia al estrés con entornos naturales o asociados a alimentos. También desarrollamos modelos de aprendizaje automático que pueden predecir con precisión las fuentes de aislamiento de los linajes de L. monocytogenes utilizando datos centrales del genoma e identificamos posibles presiones bióticas y abióticas selectivas que impulsan la asociación genómica con el entorno natural. Nuestros hallazgos sugieren que las poblaciones de especies de Listeria tienen nichos distintos en ambientes naturales y asociados a alimentos, lo que potencialmente limita la probabilidad de que las cepas de Listeria se transmitan con frecuencia entre estos dos ambientes.

Los 839 aislamientos de Listeria utilizados en este estudio (Tabla S1) incluyeron (i) 449 aislamientos recolectados del suelo en el ambiente natural en los Estados Unidos [22], (ii) 115 aislamientos reportados previamente en agua agrícola [23, 24], y (iii) 275 aislamientos de instalaciones de procesamiento de productos agrícolas [27]; El término “entorno asociado a los alimentos” se utiliza para referirse a la fuente de aislamientos en las categorías (ii) agua agrícola y (iii) instalaciones de procesamiento de productos agrícolas. Los 449 aislamientos que representan el conjunto (i) incluyeron 177 aislamientos de L. monocytogenes que representan los linajes I, II y III (n = 12, 39 y 126, respectivamente), L. seeligeri (n = 98), L. innocua (n = 33) y aislamientos de L. welshimeri (n = 141) recolectados del suelo en el entorno natural en los EE. UU. en 2018. Si bien el conjunto original informado por Liao et al., [22] también incluía aislamientos que representaban otras especies, estos aislamientos fueron no se incluye en el estudio aquí presentado ya que ninguna de estas especies estuvo representada en el conjunto de aislados asociados a alimentos. Los 115 aislamientos del conjunto (ii) incluyeron 54 aislamientos de L. seeligeri, 19 L. innocua y 42 L. welshimeri recolectados de agua agrícola en Nueva York y AZ entre 2017 y 2018. Los 275 aislamientos del conjunto (iii) incluyeron 176 L. aislados de monocytogenes que representan los linajes I, II y III (75, 68 y 33 aislados, respectivamente), así como 47 aislados de L. seeligeri, 37 L. innocua y 15 aislados de L. welshimeri; Estos aislamientos se recolectaron en instalaciones de procesamiento de productos agrícolas (empaquetadoras e instalaciones de IV gama) en los Estados Unidos entre 2017 y 2018.

En los análisis ecológicos de Listeria del suelo se incluyeron variables ambientales previamente informadas [22], incluidas la latitud, la longitud, la propiedad del suelo (17 variables), el clima (4 variables) y el uso de la tierra circundante (10 variables). En este estudio se utilizaron muestras de suelo positivas para Listeria (311 muestras en total; Tabla S2) y un número idéntico de muestras negativas (311), que se habían utilizado previamente para mediciones de las propiedades del suelo [22], para la secuenciación del gen 16 S rRNA. El suelo de cada muestra se tamizó utilizando un tamiz estéril de 2 mm. El ADN total se extrajo de cada muestra utilizando los kits QIAGEN Power Soil Pro (12888-100). El ADN se almacenó a -80 ° C hasta su posterior procesamiento. La región V4 del gen 16 S rRNA se amplificó según los métodos detallados en la Información complementaria. La secuenciación se realizó en un MiSeq utilizando una ejecución de lectura de extremos emparejados de 2 × 250 pb. El número de lecturas sin procesar entre las 622 muestras osciló entre 8599 y 59,425 (Tabla S2). Las lecturas sin procesar se procesaron utilizando QIIME2 siguiendo los tutoriales en línea (https://docs.qiime2.org/2020.2/tutorials/). Los métodos para procesar lecturas sin procesar (p. ej., dibujar la curva de rarefacción alfa, Fig. S1) y la identificación de unidades taxonómicas operativas (OTU) se detallan en la Información complementaria.

Anteriormente se informaron datos de la secuencia del genoma completo para aislados de Listeria en los conjuntos (i) y (iii) ([22, 27], respectivamente). Aquí se utilizaron métodos para la extracción de ADN, la secuenciación del genoma completo, el ensamblaje del genoma y el control de calidad de los aislados detallados anteriormente en Liao et al., [22] para secuenciar los aislados del conjunto (ii). Los SNP principales para los genomas de cada especie se determinaron utilizando kSNP3 3.1.2 [28]. Los árboles filogenéticos de cada especie se construyeron utilizando RAxML-8.2.12 [29] con 500 repeticiones de arranque basadas en los SNP principales. En la construcción del árbol se utilizó un modelo de sustitución GTR + G (tiempo general reversible + distribución gamma) determinado por jModelTest [30] con corrección de sesgo de verificación. El análisis de tipificación de secuencia multilocus del genoma central (cgMLST) se realizó utilizando una tubería interna junto con la base de datos cgMLST disponible en la plataforma BIGSdb-Lm [31] (https://bigsdb.pasteur.fr/listeria) para asignar tipos alélicos para cada genoma de L. monocytogenes. La anotación del genoma y la identificación de genes accesorios se realizaron utilizando métodos detallados en Liao et al., [22].

Los plásmidos fueron detectados por PlasmidFinder 2 utilizando un límite de identidad de 0,6 [32]. Los plásmidos previstos se agruparon en familias de plásmidos (por ejemplo, Inc18) y grupos de plásmidos (por ejemplo, rep13). Las secuencias de plásmidos se extrajeron de los genomas de cada grupo de plásmidos y se alinearon utilizando el músculo 5.1. Para cada uno de los grupos de plásmidos que albergaban más de tres genomas (es decir, rep25, rep26, repUS25 y repUS43), se construyó un árbol genético utilizando RAxML-8.2.12 [29] con 1000 repeticiones de arranque basadas en secuencias de plásmidos alineadas. En la construcción del árbol se utilizó un modelo de sustitución GTR + G determinado por jModelTest [30]. Se utilizaron genomas de todas las especies de Listeria para detectar la presencia de SSI-1, un islote de cinco genes (lmo0444 - lmo0448), y SSI-2, un islote de dos genes (lin0464 - lin0465). Los genomas de todos los genomas de L. monocytogenes se utilizaron además para determinar la presencia de genes de virulencia seleccionados, incluidos los genes encontrados en la isla de patogenicidad de Listeria 1 (LIPI-1; prfA, plcA, hly, mpl, actA, plcB), la isla de patogenicidad de Listeria 3 ( LIPI-3; llsAGHXBYDP), isla de patogenicidad de Listeria 4 (LIPI-4; LM9005581_70009 - LM9005581_70014), así como genes que codifican diferentes internalinas seleccionadas (inlAB,C,E,F,G,H,J,K,I,P). Los genes SSI y estos genes de virulencia seleccionados se detectaron utilizando BLASTN con configuraciones predeterminadas en bases de datos de referencia disponibles en la plataforma BIGSdb-Lm [31]. Se consideró presente un codón de parada prematuro en un gen determinado si se detectó un codón de parada antes del último codón del gen dentro de la longitud mínima de las secuencias de referencia. Los genes se definieron como (i) supuestamente funcionales cuando la cobertura era >0,8 y no había ningún codón de parada prematuro, (ii) supuestamente no funcionales cuando 0,3 ≤ cobertura <0,8 o el codón de parada prematuro estaba presente, y iii) ausentes cuando no había aciertos. observado en BLASTN o la cobertura fue <0,3. Se eligió una cobertura de 0,3 y 0,8 como puntos de corte porque (i) la estructura multidominio de las proteínas probablemente se conserva cuando se utiliza una cobertura de 0,8 [33], y (ii) se ha recomendado una cobertura de consulta de al menos 0,3 o menos. para identificar genes que abarcan contigs y/o tocan espacios [34]. Al calcular la presencia/prevalencia de un gen determinado en todos los genomas, solo se incluyen en el cálculo supuestos genes funcionales.

Dentro de cada especie, las asociaciones entre las fuentes de aislamiento y la presencia de (i) genes de virulencia (solo L. monocytogenes), (ii) plásmidos, (iii) islotes de supervivencia al estrés y (iv) genes accesorios se identificaron mediante las pruebas exactas de Fisher, utilizando rpy2 en Python 3.6.8. Se aplicó una corrección de la tasa de descubrimiento falso (FDR) de Benjamin y Hochberg (BH) para pruebas múltiples; Se determinó que los elementos (p. ej., genes accesorios) con una P < 0,05 ajustada por FDR estaban asociados con la fuente. La correlación entre los genes ortólogos asociados a la fuente y la familia de plásmidos Inc18 se evaluó mediante análisis de correlación Phi, utilizando sklearn.metrics en Python 3.6.8. Se utilizó un modelo de distribución binomial detallado en la Información complementaria para identificar grupos de categorías de funciones de genes ortólogos (COG) que se enriquecieron significativamente entre los genes accesorios asociados a la fuente para cada especie y cada linaje de L. monocytogenes.

El algoritmo de aumento de gradiente LightGBM implementado en scikit-learn en Python 3 se utilizó para desarrollar modelos predictivos para fuentes de aislamiento de L. monocytogenes linaje I, II y III utilizando la presencia/ausencia del perfil alélico cgMLST de cada linaje como características. Los alelos que estaban presentes o ausentes en más del 99% de las muestras se consideraron redundantes y se excluyeron de la matriz de características. En LightGBM, el parámetro de tasa de aprendizaje se configuró en 0,05, el parámetro max_profundidad se configuró en 10 y el parámetro num_leaves se configuró en 80. Todos los demás hiperparámetros están configurados en valores predeterminados. Todos los modelos de aprendizaje automático se probaron mediante doble validación cruzada. Este método divide el conjunto de datos en dos secciones, cada una de las cuales tiene una proporción similar de muestras de cada clase que el conjunto completo. Esto garantiza que los conjuntos de entrenamiento y prueba dentro de cada pliegue reflejen la distribución desigual del conjunto de datos original. En cada pliegue, una sección se utiliza para entrenamiento y la otra para pruebas. El valor promedio calculado en los dos pliegues se utiliza para evaluar el rendimiento del modelo. Se calcularon y visualizaron el área bajo la curva de la característica operativa del receptor (auROC) y el área bajo la curva de recuperación de precisión (auPR) para medir la precisión de los modos. La puntuación de importancia de la característica LightGBM se calculó utilizando la función interna de LightGBM "feature_importances_". Esto se calculó para cada pliegue dentro de la validación cruzada doble, lo que resultó en una puntuación de importancia por característica de cada pliegue. Se calculó el promedio de las puntuaciones de importancia de las características de los dos pliegues para generar una puntuación de importancia general para cada característica en cada modelo.

Se realizó una prueba de Mantel parcial entre cada variable ambiental y la identidad de nucleótidos promedio (ANI) de los genomas para cada especie de Listeria y cada linaje de L. monocytogenes, utilizando vegan en R 3.6.0 (999 permutaciones) mediante el control de variables geográficas. El ANI y la distancia geográfica se calcularon utilizando los métodos informados por Liao et al., [22]. La disimilitud ambiental se calculó en distancia euclidiana. Se aplicó una corrección BH FDR para corregir múltiples pruebas parciales de Mantel. Las variables con una P < 0,05 ajustada por FDR se definieron como variables ecológicas significativas y se incluyeron para evaluar la importancia en la predicción del ANI de Listeria en un modelo de bosque aleatorio utilizando randomForest en R 3.6.0 siguiendo los procedimientos detallados en Liao et al. [22].

La riqueza de OTU y el índice de diversidad de Shannon-Wiener se calcularon utilizando skbio en Python 3.6.8. Se realizaron pruebas t para comparar la riqueza de OTU y la diversidad de Shannon-Wiener entre muestras positivas y negativas para Listeria. La coexistencia de especies bacterianas y cada especie de Listeria y cada linaje de L. monocytogenes se evaluó inicialmente mediante un análisis de correlación Phi utilizando sklearn.metrics en Python 3. Especies bacterianas con un coeficiente de correlación Phi (r) >0,2 o <−0,2 con cada Los taxones de Listeria se definieron como taxones bacterianos que tienden a tener preferencias de hábitat similares y diferentes, respectivamente; estas especies se incluyeron en el análisis de la red de co-ocurrencia. Se construyeron redes de especies bacterianas coexistentes para cada taxón de Listeria utilizando ggraph en R 3.6.0.

Para evaluar la relación entre el genoma central de L. monocytogenes (que incluye los genomas de los tres linajes de L. monocytogenes identificados en este estudio: linaje I, II y III) y las fuentes de aislamiento (suelo versus asociadas a alimentos), primero construimos un árbol filogenético basado en SNP centrales de 177 aislados de L. monocytogenes del suelo y 176 aislados de L. monocytogenes de instalaciones de procesamiento de productos (no había aislados de L. monocytogenes disponibles en agua agrícola) (Fig. 1a). Los resultados mostraron que los linajes I y II de L. monocytogenes estuvieron significativamente dominados por los aislados de las instalaciones de procesamiento de productos agrícolas, mientras que el linaje III estuvo dominado por los aislados del suelo (P exacto de Fisher <0,001). Además, ambos linajes II y III mostraron subclados asociados al ambiente (es decir, subclados compuestos por aislados principalmente de un ambiente) (P <0,01). De acuerdo con estos hallazgos, cgMLST identificó una pequeña cantidad de pares de aislados (un aislado del suelo y otro de instalaciones de producción) en linajes de L. monocytogenes que estaban estrechamente relacionados (<50 discrepancias alélicas), incluidos 42, 5 y 1 par(es). ) dentro de los linajes I, II y III, respectivamente (Fig. 1b, Tabla S3). Estos pares incluyeron 31, 5 y 1 aislado(s) de instalaciones agrícolas que estaban estrechamente relacionados con uno o más aislados de suelo para los linajes I, II y III, respectivamente. Estos resultados muestran que el genoma central de L. monocytogenes está fuertemente asociado con los tipos de entornos y puede tener el poder de predecir fuentes de aislamiento a nivel de linaje.

un árbol filogenético de máxima probabilidad para L. monocytogenes basado en SNP centrales de 177 aislados del suelo (puntas en verde) y 176 aislados de instalaciones de procesamiento de productos agrícolas (plantas de alimentos) (puntas en rojo) con 500 repeticiones de arranque. Los valores de Bootstrap >70% se indican mediante círculos grises en los nodos de bifurcación. El árbol tenía sus raíces en el punto medio. Las ramas están codificadas por colores según los linajes de L. monocytogenes. El árbol está marcado por la presencia/ausencia de genes de virulencia. Las matrices de genes de presencia/ausencia desde el interior al exterior representan (i) genes ubicados en las islas de patogenicidad LIPI-1 (prfA, plcA, hly, mpl, actA, plcB), (ii) genes que codifican internalinas (inlABCEFGHJKIP), y (iii) genes ubicados en las islas de patogenicidad LIPI-3 (llsAGHXBYDP) y LIPI-4 (LM9005581_70009 a LM9005581_70014). Un cuadro lleno representa la presencia de un gen funcional putativo; un cuadro vacío representa un gen no funcional (es decir, que está truncado o que tiene codones de parada prematuros); y un cuadro blanco representa la ausencia del gen. b Histogramas que muestran la distribución de discrepancias alélicas de cgMLST entre aislados del suelo e instalaciones de procesamiento de productos (plantas de alimentos) para L. monocytogenes (LM) linaje I (rojo), II (azul) y III (amarillo). c Curvas ROC y PR para clasificadores binarios entrenados en perfiles alélicos cgMLST de aislados de linaje I, II y III de LM. auROC: área bajo la curva de la característica operativa del receptor, auPR: área bajo la curva de recuperación de precisión. Árbol filogenético de máxima probabilidad de (d) L. innocua, (e) L. welshimeri y (f) L. seeligeri basado en los SNP principales de aislados de cada especie; los aislados se obtuvieron del suelo, agua agrícola (ag.) e instalaciones de procesamiento de productos (“plantas alimenticias”). Los árboles se construyeron basándose en 1000 repeticiones de arranque y se enraizaron en el punto medio. Las etiquetas de los aislados están codificadas por colores según las fuentes. Los valores de Bootstrap >70% se indican mediante círculos grises en los nodos de bifurcación.

Para probar la hipótesis sobre la previsibilidad de las fuentes de aislamiento de los linajes de L. monocytogenes utilizando datos centrales del genoma, empleamos un algoritmo de aprendizaje automático, aumento de gradiente, para clasificar las fuentes de aislamiento para cada linaje utilizando perfiles cgMLST como características. Nuestro modelo obtuvo una precisión superior para el linaje II y III (auROC = 0,89, auPR = 0,85 y auROC = 0,88, auPR = 0,95, respectivamente) y una precisión limitada (auROC = 0,59, auPR = 0,18) para el linaje I (Fig. 1c). Entre las 50 características más importantes (genes centrales) para predecir las fuentes de aislamiento de cada linaje (Fig. S2), varios genes codifican proteínas de la superficie celular, incluida la subunidad IIC del transportador de manosa PTS, la subunidad IIA del transportador de glucosa PTS y el transportador de fructosa PTS. subunidad IIA y proteína de varilla del cuerpo basal flagelar FlgC para el linaje I (Tabla S4), proteína de varilla del cuerpo basal flagelar FlgB, subunidad IIA del transportador de manitol PTS, permeasa del transportador ABC del azúcar, transportador de formiato, subunidad IIB del transportador de azúcar PTS y beta- subunidad transportadora de glucósido IIB para el linaje II (Tabla S5), y subunidad transportadora de azúcar PTS IIA, subunidad transportadora de beta-glucósido PTS IIABC y proteína de modificación de varilla del cuerpo basal flagelar para el linaje III (Tabla S6). Estos resultados sugieren que, gracias a las técnicas de aprendizaje automático, los datos centrales del genoma son altamente predictivos para las fuentes de aislamiento de L. monocytogenes a nivel de linaje, y los genes centrales involucrados en las funciones de la superficie celular están fuertemente asociados con las fuentes de aislamiento.

Para comprender mejor la relación entre los genomas centrales y las fuentes de aislamiento en otras especies de Listeria, evaluamos la relación genética entre los aislamientos de L. seeligeri, L. innocua y L. welshimeri del suelo, el agua agrícola y las instalaciones de procesamiento de productos agrícolas basados ​​en los SNP centrales. ; el número de aislamientos de los tres ambientes fue 98, 54 y 47 para L. seeligeri, 33, 19 y 37 para L. innocua y 141, 42 y 15 para L. welshimeri, respectivamente. Según los árboles filogenéticos, los aislados de L. innocua y L. welshimeri (que representaban 4 y 5 clados principales, respectivamente) se agruparon fuertemente por entornos (Fig. 1d, e; P exacto de Fisher <0, 001 para ambas especies). L. seeligeri tenía dos subclados principales (A y B) con una mezcla de aislados del suelo, agua agrícola e instalaciones de procesamiento de productos agrícolas, y los aislados del suelo estuvieron significativamente sobrerrepresentados en el subclado B en comparación con el subclado A (Fig. 1f; P < 0,01). De acuerdo con estos resultados, detectamos una pequeña cantidad de pares de aislados estrechamente relacionados (una diferencia central de SNP <50) entre ambientes naturales y asociados a alimentos (es decir, suelo versus agua agrícola, o suelo versus instalaciones de procesamiento de productos agrícolas) en L. seeligeri, L. innocua y L. welshimeri (22, 9 y 0 pares, respectivamente; Fig. S3, Tabla S7). Para estas especies se utilizaron diferencias de SNP en lugar de diferencias de cgMLST porque el esquema cgMLST solo está disponible para L. monocytogenes. Estos resultados muestran que los aislamientos de L. seeligeri, L. innocua y L. welshimeri de ambientes naturales y asociados con alimentos no están estrechamente relacionados.

Dado que el genoma central de cada especie de Listeria está asociado con fuentes de aislamiento, planteamos la hipótesis de que el genoma accesorio también difiere según el entorno. Para probar nuestra hipótesis, empleamos las pruebas exactas de Fisher para identificar genes accesorios de especies de Listeria asociados al medio ambiente en función de la presencia/ausencia de un gen determinado en entornos naturales y asociados a los alimentos. Identificamos 902 genes accesorios en todos los L. monocytogenes, así como 50, 36 y 195 genes accesorios en los linajes I, II y III, respectivamente, que se asociaron significativamente con fuentes de aislamiento (es decir, suelo e instalaciones de procesamiento de productos agrícolas). incluidos 450, 50, 29 y 80 sobrerrepresentados entre los aislados del suelo y 452, 0, 7 y 115 sobrerrepresentados entre los aislados de las instalaciones de procesamiento de productos agrícolas, respectivamente (P <0,05 ajustado exacto de Fisher; Fig. 2a, Fig. S4 , Cuadro S8). Para L. seeligeri, L. innocua y L. welshimeri, un total de 6, 357 y 306 genes accesorios se asociaron significativamente con las fuentes (es decir, suelo, agua agrícola, instalaciones de procesamiento de productos agrícolas), respectivamente (P ajustado < 0,05; Figura 2b, Tabla S9).

Prevalencia de genes accesorios asociados a la fuente (a) entre el suelo y los aislados de L. monocytogenes (LM) de las instalaciones de procesamiento de productos agrícolas (plantas alimenticias) y (b) entre los aislados de L. seeligeri del suelo, el agua agrícola (ag.) y las plantas alimenticias , L. innocua y L. welshimeri. Los puntos están codificados por colores según las categorías funcionales del COG. El tamaño de los puntos es proporcional al logaritmo 10 del número de genes anotados como una categoría COG. Las abreviaturas de las categorías COG se describen a continuación. C: Producción y conversión de energía; D: control del ciclo celular, división celular, partición cromosómica; E: Transporte y metabolismo de aminoácidos; F: Transporte y metabolismo de nucleótidos; G: Transporte y metabolismo de carbohidratos; H: Transporte y metabolismo de coenzimas; I: Transporte y metabolismo de lípidos; J: Traducción, estructura ribosómica y biogénesis; K: Transcripción; L: replicación, recombinación y reparación; M: biogénesis de pared celular/membrana/envoltura; N: Motilidad Celular; O: modificación postraduccional, recambio proteico, acompañantes; P: Transporte y metabolismo de iones inorgánicos; P: Biosíntesis, transporte y catabolismo de metabolitos secundarios; S: Función desconocida; T: Mecanismos de transducción de señales; U: tráfico, secreción y transporte vesicular intracelular; V: Mecanismos de defensa. c Análisis de enriquecimiento de categorías funcionales COG para genes asociados a la fuente en LM (gris), linaje LM I (rojo), II (azul) y III (amarillo), L. seeligeri (marrón), L. innocua (verde), y L. welshimeri (púrpura). El índice de enriquecimiento >2 (línea discontinua negra) indica que la categoría COG está significativamente enriquecida (P <0,05). El tamaño del círculo es proporcional al logaritmo del número de genes anotados como una categoría COG.

El análisis de enriquecimiento funcional mostró que entre los genes accesorios asociados a la fuente, (i) la “biogénesis de pared celular/membrana/envoltura (M)” se enriqueció significativamente en L. monocytogenes, L. monocytogenes linaje II, L. innocua y L. welshimeri, (ii) “Transporte y metabolismo de carbohidratos (G)” se enriqueció significativamente en L. monocytogenes linaje III y L. welshimeri; y (iii) el "tráfico intracelular, secreción y transporte vesicular (U)" se enriqueció significativamente en L. welshimeri (P <0,05; Fig. 2c). Entre los 88 genes accesorios asociados a la fuente anotados como “biogénesis de pared celular/membrana/envoltura (M)” en L. monocytogenes, 12 genes fueron anotados como una proteína repetida rica en leucina (LRR), todos los cuales estaban significativamente sobrerrepresentados de aislados del suelo excepto dos genes (Tabla S8). Entre los 24 y 15 genes accesorios asociados a la fuente anotados como "Transporte y metabolismo de carbohidratos (G)" en L. welshimeri y L. monocytogenes linaje III, al menos 6 y 4 genes estaban involucrados en el sistema de fosfotransferasa (PTS), respectivamente, casi todos los cuales estaban significativamente sobrerrepresentados en entornos asociados a los alimentos (Tablas S8, S9). Entre los nueve genes accesorios asociados a la fuente anotados como "tráfico intracelular, secreción y transporte vesicular (U)" en L. welshimeri, tres genes se anotaron como una proteína del sistema de secreción de tipo IV (Tabla S9). Estos resultados indican una fuerte asociación entre los genomas accesorios de las especies de Listeria, en particular los genes implicados en la síntesis de la envoltura celular y el metabolismo de los carbohidratos, y los entornos.

Se ha informado que muchos elementos genéticos (p. ej., genes de virulencia, plásmidos y genes de respuesta al estrés) desempeñan un papel en la adaptación bacteriana a un entorno particular [17, 18]. Por lo tanto, perfilamos genes de virulencia en L. monocytogenes y plásmidos e islotes de supervivencia al estrés en todas las especies estudiadas aquí. Todos los aislados de L. monocytogenes de entornos tanto naturales como asociados a alimentos albergaban un LIPI-1 funcional putativo, excepto 6 de 87 aislados del linaje I y 5 de 159 aislados del linaje III en los que se detectó un codón de parada prematuro en el gen actA (Fig. .1a). Los genes de internalina (inlABCEFGHJKIP) estaban presentes en la mayoría de los aislados de L. monocytogenes, y algunos genes de internalina (p. ej., inlF e inlG) mostraron una prevalencia más baja, particularmente entre los aislados del linaje III (Fig. 1a). LIPI-3 fue común entre los aislados del linaje I, con una prevalencia del 78,2% en comparación con el 6,5% y el 3,8% entre los aislados del linaje II y III (Fig. 1a). LIPI-4 fue más prevalente en comparación con LIPI-3 y se encontró en 43,7%, 9,3% y 43,4% de los aislados de linaje I, II y III, respectivamente (Fig. 1a). Todos los genes LIPI-3 y LIPI-4 funcionales putativos, así como la mayoría de los genes de internalina funcionales putativos (inlA, inlC, inlE, inlF, inlG, inlH, inlI, inlP), se asociaron significativamente con las fuentes (p ajustado exacto de Fisher <0,05). ; Figura S6). Los supuestos genes funcionales inlA y LIPI-4 estuvieron significativamente sobrerrepresentados entre los aislados del suelo, mientras que los supuestos genes funcionales inlC, inlE, inlF, inlG, inlH, inlI, inlP y LIPI-3 estuvieron significativamente sobrerrepresentados entre los aislados de las instalaciones de procesamiento de productos agrícolas. (P ajustado <0,05; Fig. S6). Si bien inlA e inlB están en el mismo operón, solo inlA estuvo sobrerrepresentado en aislados de suelo debido a que el codón prematuro estaba presente en más aislados de instalaciones de procesamiento de alimentos en comparación con inlB.

Los plásmidos no fueron comunes entre los aislados de Listeria, con una prevalencia del 14,4% (51/353), 3,5% (7/199), 33,7% (30/89), 19,2% (38/198) en L. monocytogenes, L. seeligeri, L. innocua y L. welshimeri, respectivamente (Tabla S10). La frecuencia de plásmidos en L. monocytogenes, L. monocytogenes linaje I, linaje III y L. innocua se asoció significativamente con las fuentes de aislamiento (P exacta de Fisher <0,05; Fig. 3a, b). En particular, los plásmidos estuvieron sobrerrepresentados entre los aislados de suelo de L. monocytogenes y el linaje III y exclusivamente presentes entre los aislados de suelo de L. monocytogenes linaje I, mientras que para L. innocua, los plásmidos estuvieron significativamente sobrerrepresentados entre los aislados de las instalaciones de procesamiento de productos agrícolas (Fig. .3a,b). Los plásmidos clasificados en la familia Inc18 estaban altamente correlacionados con una serie de genes accesorios asociados a la fuente en L. monocytogenes (10 genes), L. monocytogenes linaje I (50 genes) y L. innocua (59 genes) (correlación Phi r > 0,5; figura S8, tabla S11). Muchos de estos genes correlacionados con plásmidos estaban anotados con funciones involucradas en la replicación, como resolvasa y recombinasa, y algunos estaban involucrados en la resistencia a metales (p. ej., operón represor de resistencia al arsénico) (Tabla S11). Es de destacar que se detectaron un total de nueve grupos de plásmidos, incluidos rep13, rep25, rep26, rep32, rep33, rep35, rep7a, repUS25 y repUS43. Para inferir la posible transferencia horizontal de plásmidos entre entornos y especies, construimos un árbol de genes para cada uno de los cuatro grupos de plásmidos que albergaban más de tres genomas (rep25, rep26, repUS25 y repUS43). Descubrimos que el grupo de plásmidos más grande, repUS25, estaba presente predominantemente en aislados del suelo (81% de 84 aislados) y exhibía dos clados principales con una mezcla de aislados tanto del suelo como de ambientes asociados a alimentos y las cuatro especies, L. monocytogenes. , L. seeligeri, L. welshimeri y L. innocua (Fig. 3c). El grupo de plásmidos repUS43 estuvo presente predominantemente en aislados de ambientes asociados a alimentos (91% de 11 aislados) y se detectó exclusivamente en L. innocua (Fig. 3d). El grupo de plásmidos rep25 también estuvo predominantemente presente en aislados de ambientes asociados a alimentos (97% de 29 aislados) y exhibe dos clados principales con una mezcla de aislados de L. innocua y L. monocytogenes linaje II (Fig. 3e). El grupo de plásmidos rep26 se encontró exclusivamente en aislados de instalaciones de procesamiento de alimentos y formó dos clados principales, uno con aislados de L. welshimeri y L. inncoua y el otro con L. monocytogenes linaje II y L. welshimeri (Fig. 3f). Estos resultados sugieren que los grupos de plásmidos están fuertemente asociados con fuentes de aislamiento y algunos plásmidos (por ejemplo, repUS25, rep25) pueden transferirse entre ambientes y especies en Listeria.

Prevalencia de (a) plásmidos entre L. monocytogenes (LM) y aislados de linaje I, II, III de LM, (b) plásmidos entre aislados de L. seeligeri, L. innocua y L. welshimeri. Árbol de máxima probabilidad para el grupo de plásmidos (c) repUS25, (d) repUS43, (e) rep25, (f) rep26 basado en secuencias de nucleótidos de 84, 11, 29 y 9 aislados de Listeria respectivamente con 500 repeticiones de arranque. Los valores de Bootstrap se muestran en los nodos de bifurcación. El árbol tenía sus raíces en el punto medio. Las puntas están codificadas por colores según las fuentes de aislamiento (verde: suelo, rojo: instalaciones de procesamiento de alimentos y gris: agua agrícola). g genes SSI entre LM y LM linaje III, y (h) genes SSI entre aislamientos de L. innocua y L. welshimeri de diferentes fuentes, incluido el suelo, el agua agrícola (ag.) y las instalaciones de procesamiento de productos (plantas alimenticias). "***", "**" y "*" indican que la distribución de plásmidos o genes SSI depende significativamente de fuentes en el nivel de P de 0,001, 0,01 y 0,05, respectivamente, en las pruebas exactas de Fisher.

Además, observamos una fuerte asociación entre los supuestos islotes de supervivencia al estrés funcional y las fuentes de aislamiento en algunos taxones de Listeria. Se detectó SSI-1 en el 24,9% de los aislados de L. monocytogenes, incluidos los linajes I, II y III (Fig. S5, Fig. 3g). SSI-1 para L. monocytogenes y su linaje III se enriqueció significativamente entre los aislados de instalaciones de procesamiento de alimentos (P ajustado exacto de Fisher <0,05, Fig. 3g). SSI-1 se encontró en el 89,1% de los aislados de L. welshimeri, pero no se asoció significativamente con las fuentes (Fig. 3h). La diferencia en la prevalencia entre SSI-1 lmo0444 y otros genes SSI-1 fue causada por un codón de parada prematuro presente en lmo0444 de un aislado de suelo y un aislado de agua agrícola (Fig. 3h). Se detectó SSI-2 en el 50,1% de los aislados de L. monocytogenes, incluidos los linajes II y III (Fig. S5, Fig. 3g). SSI-2 para L. monocytogenes y su linaje III se enriqueció significativamente entre los aislados del suelo (P ajustado <0,05, Fig. 3g). SSI-2, que se encuentra en el 82,0% de los aislamientos de L. innocua, estuvo significativamente sobrerrepresentado entre los aislamientos de agua agrícola e instalaciones de procesamiento de productos (P ajustado <0,05, Fig. 3h). No se detectaron genes SSI-1 y SSI-2 funcionales putativos en ningún aislado de L. innocua y L. welshimeri, respectivamente, y no se detectaron genes SSI-1 ni SSI-2 funcionales putativos en ningún aislado de L. seeligeri.

Dada la gran divergencia genómica asociada con los entornos de Listeria, buscamos identificar factores abióticos que potencialmente contribuyan a la diversificación. Analizamos el conjunto de datos genómicos de aislados de suelo que se combina con un conjunto de datos completo de factores ambientales, incluida la ubicación geográfica, la propiedad del suelo, el clima y el uso de la tierra [22]. Utilizando pruebas parciales de Mantel, identificamos varias variables ambientales corregidas por la distancia geográfica que se correlacionaron significativamente con la similitud genética de L. monocytogenes, L. monocytogenes linaje II, L. seeligeri y L. innocua según el ANI (P ajustado < 0,05) ( Figura 4a, Tabla S12); estas variables se denominaron "impulsores abióticos" de la variación genética en estos taxones. Los impulsores abióticos de L. monocytogenes fueron 11 variables del suelo (p. ej., aluminio, materia orgánica, manganeso), tres variables climáticas (p. ej., precipitación) y cuatro variables de uso de la tierra (p. ej., pastizales). Todos los impulsores abióticos del linaje II de L. monocytogenes fueron variables del suelo, incluido el nitrógeno total, la humedad, el carbono total, el potasio y el sodio. Los impulsores abióticos de L. seeligeri fueron cuatro variables del suelo (p. ej., pH, manganeso), las cuatro variables climáticas y tres variables de uso de la tierra (p. ej., pastizales, pastos). Los impulsores abióticos de L. innocua incluyeron cinco variables del suelo (p. ej., azufre, magnesio), dos variables climáticas (temperaturas máxima y mínima) y dos variables de uso de la tierra (humedales y matorrales). No se identificaron impulsores abióticos para L. monocytogenes linaje I y III o L. welshimeri.

a Correlación de Mantel parcial entre el ANI de aislados de L. monocytogenes (LM), linaje I, II y III de LM, L. seeligeri, L. innocua y L. welshimeri y la disimilitud de las variables ambientales correlacionadas con la distancia geográfica. r es el coeficiente de Mantel Parcial. Las correlaciones significativas (P ajustada < 0,05) se indican con “*”. Las etiquetas de las variables de suelo, clima y uso de la tierra en el eje y están codificadas por colores en rojo, verde y azul, respectivamente. Desarrollado A: espacio abierto desarrollado con <20% de cobertura impermeable; Desarrollado B: espacio abierto desarrollado con >20% de cobertura impermeable. b Importancia variable en la predicción del ANI de aislados de LM, linaje II de LM, L. seeligeri y L. innocua según el índice % Inc MSE en un modelo de bosque aleatorio. Las variables abióticas en el eje y se clasifican en orden ascendente según el valor medio de % Inc MSE de 1000 repeticiones. “espacial” indica distancia geográfica. Los valores mínimo y máximo se representan mediante cortas líneas verticales de bigotes; el cuadro indica los cuartiles superior e inferior, y la línea corta dentro del cuadro indica la mediana. Los puntos por encima y por debajo de los bigotes indican valores atípicos. Las cajas y los bigotes están codificados por colores según grupos de variables ecológicas. c Red de especies bacterianas concurrentes y LM, L. seeligeri, L. innocua y L. welshimeri. Cada nodo representa una especie bacteriana que tenía un coeficiente de correlación Phi (r) > 0,2 o < −0,2 con una especie de Listeria. Los nodos que representan especies de Listeria están en negro (estos datos se basan en datos de cultivo generados, no en datos de secuenciación de amplicones 16 S), y otros nodos que representan especies bacterianas concurrentes están codificados por colores por filo. Una arista representa la correlación Phi con una r > 0,2 o < −0,2 entre los dos nodos. El espesor del borde es proporcional al valor absoluto de la correlación Phi r. Un borde naranja representa una correlación positiva, mientras que un borde gris representa una correlación negativa.

Para cuantificar la importancia relativa de los impulsores abióticos de L. monocytogenes, L. monocytogenes linaje II, L. seeligeri y L. innocua, desarrollamos modelos forestales aleatorios para predecir el ANI de aislados que representan estos taxones utilizando variables ambientales significativas. Según el % Inc MSE (Fig. 4b) y la pureza del nodo Inc (Fig. S7), las dos variables más importantes fueron (i) precipitación y aluminio (para L. monocytogenes); (ii) potasio y sodio (para el linaje II de L. monocytogenes); (iii) proximidad al bosque y velocidad del viento (para L. seeligeri), y (iv) temperatura máxima/mínima anual y proximidad a humedales (para L. innocua). Estos resultados sugieren que la variación genómica dentro de las especies de Listeria está influenciada conjuntamente por la ubicación geográfica, las propiedades del suelo, el clima y el uso de la tierra, y que los factores abióticos clave varían entre los diferentes taxones.

Además de los factores abióticos, los factores bióticos también pueden actuar como presiones selectivas y contribuir a la diversificación genómica bacteriana. Por lo tanto, caracterizamos aún más las comunidades bacterianas de muestras de suelo seleccionadas en este estudio utilizando la secuenciación del amplicón del gen 16S rRNA. La riqueza y la diversidad de Shannon-Wiener de OTU bacterianas para muestras positivas para todos los taxones estudiados aquí fueron significativamente mayores que las de las muestras negativas para Listeria (prueba t P <0,05 para todos; Fig. S9). Para identificar especies bacterianas candidatas que puedan contribuir a la diversificación genómica en las especies de Listeria, analizamos el patrón de coocurrencia de las especies de Listeria y 1172 especies bacterianas detectadas mediante el análisis de correlación Phi. Un total de 22, 14, 4 y 30 especies exhibieron una correlación positiva relativamente fuerte con L. monocytogenes, L. seeligeri, L. innocua y L. welshimeri, respectivamente (correlación Phi r > 0,2; Tabla S13). Una gran proporción de las especies correlacionadas positivamente con L. monocytogenes y L. innocua (41% y 50%, respectivamente) se clasificaron en el filo Proteobacteria, incluidas las familias Hyphomicrobiaceae y Rickettsiaceae; El 29% de las especies correlacionadas positivamente con L. seeligeri se clasificaron en el filo Planctomycetes, incluida la familia Pirellulaceae; y el 33% de las especies correlacionadas positivamente con L. welshimeri se clasificaron en el filo Actinobacteria, incluida la familia Pseudonocardiaceae (Fig. 4c, Tabla S13). Estas especies correlacionadas positivamente pueden ocupar hábitats similares a los de estas especies de Listeria.

Por el contrario, un número menor de especies exhibió una correlación negativa relativamente fuerte con estas cuatro especies de Listeria (12, 1, 0 y 8 especies, respectivamente; correlación Phi r <-0,2; Tabla S13). Un total del 83% de las especies correlacionadas negativamente con L. monocytogenes se clasificaron en el filo Actinobacteria, incluida la familia Geodermatophilaceae (p. ej., Geodermatophilus obscurus) y Pseudonocardiaceae (p. ej., Pseudonocardia halophobica); El 100% de las especies correlacionadas negativamente con L. seeligeri se clasificaron en el filo Acidobacteria; y el 50% de las especies correlacionadas negativamente con L. welshimeri se clasificaron en el filo Proteobacteria, incluida la familia Methylocystaceae (Fig. 4c, Tabla S13). Para los linajes I, II y III de L. monocytogenes, un total de 9, 3 y 16 especies y un total de 0, 1 y 4 especies exhibieron una correlación positiva y negativa relativamente fuerte, respectivamente (r > 0,2 y r < −0,2, respectivamente (Fig. S10, Tabla S13). Estas especies bacterianas correlacionadas negativamente pueden preferir hábitats diferentes o distintos a los de estos taxones de Listeria. En resumen, proponemos que ciertas especies de Proteobacteria y Actinobacteria son taxones de interés que podrían ejercer presiones selectivas sobre Listeria y contribuir a la evolución de su genoma en el ambiente del suelo.

Aquí, empleamos análisis genómicos comparativos en profundidad en un extenso conjunto de datos genómicos de aislados de Listeria recolectados por nosotros del suelo, agua agrícola e instalaciones de procesamiento de alimentos en los EE. UU. para estudiar la diversificación genómica de cuatro especies importantes de Listeria en ambientes naturales y asociados a los alimentos. . En general, nuestros resultados sugieren que las especies de Listeria remodelan tanto los genomas centrales como los genomas accesorios y se adaptan diferencialmente a entornos naturales y asociados a alimentos. Nuestra hipótesis es que dicha adaptación diferencial existe en Listeria respecto de otros ambientes naturales (p. ej., agua de río) y también de ambientes asociados a alimentos, impulsada por diferentes factores intrínsecos y extrínsecos. Además, nuestros resultados sugieren que la probabilidad de transmisión de Listeria desde entornos naturales a entornos asociados a alimentos puede ser baja debido a limitaciones en la composición genética y las presiones ambientales.

Las fuertes asociaciones observadas entre la diversificación del genoma y las fuentes de aislamiento de especies de Listeria sugieren que la división de la diversificación del genoma entre aislados del suelo y ambientes asociados a alimentos podría estar asociada con la introducción de Listeria desde su hábitat primario en la naturaleza a la cadena de producción de alimentos, lo que puede implicar cambios en el estilo de vida (p. ej., de un estilo de vida saprofito a un estilo de vida facultativamente intracelular y patógeno en especies patógenas [35]). Para estudios futuros es necesario inferir un momento en el tiempo para este evento de división mediante la inclusión de genomas de aislados muestreados en un rango más amplio de puntos de tiempo.

Tanto los genes centrales asociados al entorno como los genes accesorios identificados en este estudio se enriquecieron para funciones implicadas en la biogénesis de la envoltura celular. La envoltura celular es la capa más externa que media la interacción entre los microbios y sus entornos y, por lo tanto, puede sufrir una fuerte selección [36]. Nuestros resultados son consistentes con hallazgos previos de que la regulación positiva de los genes implicados en la respuesta al estrés de la envoltura celular en Listeria está relacionada con la exposición a condiciones de estrés asociadas a los alimentos [37,38,39,40]. Por ejemplo, en respuesta al cloruro de bencetonio, que es un compuesto de amonio cuaternario comúnmente utilizado como desinfectante en el entorno de procesamiento de alimentos, se informó que L. monocytogenes regula positivamente varios genes y vías genéticas implicadas directa o indirectamente en la biosíntesis de la pared celular (p. ej. , mnaA y tagGH, que codifican proteínas implicadas en la biogénesis del ácido teicoico) [38]. Si bien la mayoría de estos estudios identificaron la respuesta al estrés de Listeria a nivel transcripcional (por ejemplo, expresión diferencial de genes), nuestros resultados sugieren que la ganancia y pérdida de genes implicados en la biogénesis de la pared celular y la membrana también puede ser un mecanismo importante que subraya la respuesta al estrés de Listeria a nivel transcripcional (por ejemplo, expresión diferencial de genes). Adaptación de Listeria a posibles tensiones asociadas a estos hábitats. Un grupo notable de genes clasificados como involucrados en la biosíntesis de la envoltura celular fueron los genes que codifican las proteínas LRR, que son vitales para una variedad de interacciones proteína-proteína en muchas bacterias [41, 42]. L. monocytogenes codifica una familia multigénica de proteínas LPXTG que contienen LRR, incluidas las internalinas que se utilizan en la adhesión e invasión de las células huésped [43]. Dado que las internalinas tienden a ser menos importantes para la supervivencia de L. monocytogenes en el entorno no huésped, en teoría, mantener estos genes en estos entornos puede suponer un costo metabólico [19]. La subrepresentación de genes que supuestamente codifican proteínas LRR en aislados de instalaciones de procesamiento de alimentos y la subrepresentación de genes de internalina, incluidos inlC, inlE, inlF, inlG, inlH, inlI, inlP, en aislados del suelo sugiere un mayor costo metabólico y una mayor tasa de pérdida de estos genes en L. monocytogenes en las instalaciones de procesamiento de alimentos y en el suelo, respectivamente, en comparación con el otro entorno.

Otra categoría de funciones interesante enriquecida entre los genes accesorios asociados al medio ambiente fue el transporte y el metabolismo de los carbohidratos. Al vivir un estilo de vida saprotrófico, Listeria está genéticamente equipada para acceder a diversas fuentes de carbono de múltiples entornos no huéspedes [44]. La asociación de las funciones de transporte y metabolismo de carbohidratos con fuentes de aislamiento puede deberse a las diferencias en la abundancia y el tipo de carbohidratos que se encuentran en los entornos naturales y asociados a los alimentos. Además, la accesibilidad a los carbohidratos puede diferir entre estos dos entornos; por ejemplo, los carbohidratos del suelo normalmente se mezclan con otras sustancias orgánicas (p. ej., residuos de materiales vegetales y microbianos, humus) [45]. En particular, muchos genes asociados al medio ambiente implicados en el transporte y el metabolismo de los carbohidratos, incluido LIPI-4 [46], son genes PTS, que codifican funciones que median la absorción de una variedad de azúcares [47]. Estudios anteriores han informado niveles más altos de transcripción de activadores conocidos de múltiples sistemas PTS (p. ej., glucosa/glucósido, manosa-fructosa-sorbosa) en el suelo [48]. Nuestros datos sugieren que la ganancia y pérdida de genes involucrados en el sistema PTS probablemente también contribuya a la adaptación de Listeria a diferentes ambientes.

Como importantes impulsores de la evolución bacteriana, los plásmidos codifican una variedad de funciones que permiten la adaptación a diferentes tensiones en las bacterias, incluida Listeria [18, 49]. Encontramos una sobrerrepresentación de plásmidos en L. monocytogenes, particularmente el linaje I y III, del suelo en comparación con los aislados de las instalaciones de procesamiento de productos. Curiosamente, varios estudios demostraron que los plásmidos estaban sobrerrepresentados en aislados de L. monocytogenes de entornos asociados a alimentos en comparación con los de casos clínicos [50, 51]. Parece que el cambio de hábitat del entorno natural a un entorno asociado a alimentos, y luego a huéspedes donde viven un estilo de vida patógeno facultativo, se acompaña de una persistencia reducida de los plásmidos en este patógeno. Se sabe que el mantenimiento de los plásmidos se ve obstaculizado por dos factores principales: la carga generada por los plásmidos en la célula huésped y la tasa de pérdida de plásmidos durante la división celular [49]. Nuestros resultados sugieren que la carga metabólica y/o la tasa de pérdida de plásmidos pueden ser mayores para L. monocytogenes en un ambiente asociado a alimentos, posiblemente causado por condiciones desfavorables en comparación con el ambiente natural. Sin embargo, observamos un patrón opuesto en L. innocua, es decir, una sobrerrepresentación de plásmidos en aislados de ambientes asociados a alimentos en comparación con el ambiente natural. Curiosamente, detectamos una alta correlación entre la familia de plásmidos Inc18 y varios genes asociados al medio ambiente que codifican funciones relacionadas con la resistencia a los metales (por ejemplo, resistencia al cobre y al arsénico) en esta especie, lo que coincide con la detección previa de genes de resistencia al cadmio, cobre y arsenito en Listeria. plásmidos [52]. Estos resultados sugieren que mantener una gran abundancia de plásmidos en un entorno asociado a alimentos puede aumentar la aptitud de L. innocua, supuestamente en respuesta al estrés por metales pesados.

Los islotes de supervivencia al estrés codifican funciones que se espera faciliten el crecimiento de Listeria en condiciones subóptimas [53, 54]. Hasta ahora, se han identificado dos islotes de supervivencia al estrés en Listeria; Se informó que SSI-1, un islote de cinco genes (lmo0444 - lmo0448), facilita el crecimiento de Listeria a pH bajo y altas concentraciones de sal [53], y se informó que SSI-2, un islote de dos genes (lin0464 - lin0465). ser beneficioso a pH alto y en condiciones oxidativas [54]. Estudios anteriores sugirieron que los genes SSI-1 y SSI-2 están asociados con subgrupos específicos de especies de L. monocytogenes y Listeria [54,55,56]. Por ejemplo, para Listeria aislada de entornos de procesamiento de productos agrícolas, SSI-1 fue especialmente prevalente entre los aislados de secuencia tipo (ST) 14 de L. monocytogenes, mientras que SSI-2 se encontró predominantemente en los aislados de L. monocytogenes ST121 y L. innocua [55]. Aquí mostramos que SSI-1 y SSI-2 también están asociados con entornos. La sobrerrepresentación de SSI-1 en aislados de L. monocytogenes linaje III de ambientes asociados con alimentos posiblemente le permita hacer frente al estrés ácido y osmótico presente en estos ambientes, mientras que la sobrerrepresentación de SSI-2 en aislados de L. innocua de Los entornos asociados a los alimentos posiblemente le permitan hacer frente al estrés alcalino y oxidativo presente en estos entornos.

Los dos entornos estudiados aquí (es decir, el entorno natural [suelo] y los entornos asociados a los alimentos [agua agrícola e instalaciones de procesamiento de productos agrícolas]) representan condiciones distintas para la supervivencia y el destino de Listeria. Si bien el suelo es un ambiente heterogéneo y pueden ocurrir cambios ambientales inesperados, sus propiedades fisicoquímicas, en general, permanecen estables [20, 21]. En comparación, el agua agrícola y las instalaciones de procesamiento de productos agrícolas pueden representar un entorno más estresante y menos estable (por ejemplo, debido a grandes fluctuaciones de temperatura en el agua agrícola y grandes fluctuaciones en el pH y la disponibilidad de nutrientes, y la presencia de compuestos químicos y antimicrobianos en los productos agrícolas). instalaciones de procesamiento) [16]. Nuestros datos muestran que la divergencia genómica de las especies de Listeria y los linajes de L. monocytogenes está asociada con diferentes combinaciones de variables de suelo, clima y uso de la tierra. Además de algunos factores edáficos (p. ej., pH, humedad) que se sabe que son importantes para L. monocytogenes [11, 57, 58], identificamos varias otras variables del suelo (p. ej., concentraciones de aluminio, hierro, materia orgánica), así como el clima y variables de uso de la tierra (p. ej., precipitación, proporción de pastizales) que no se han relacionado con frecuencia con la ecología y la evolución de L. monocytogenes en el suelo. Además, encontramos que las variables climáticas eran particularmente importantes para las especies de Listeria no patógenas, incluidas L. seeligeri y L. innocua, que pueden desencadenar directa o indirectamente adaptaciones en estas especies [59].

Listeria en el suelo interactúa no sólo con elementos abióticos sino también con otros organismos [44]. Tales interacciones pueden influir en el ensamblaje de las poblaciones de Listeria y contribuir a su adaptación al entorno del suelo, lo que afecta indirectamente la diversidad genómica de las poblaciones de Listeria. Se encontró que varias especies de Proteobacteria estaban correlacionadas positivamente con la detección de especies de Listeria. Si bien, en general, se supone que las asociaciones positivas entre dos taxones bacterianos son causadas por la cooperación (por ejemplo, para la adquisición de nutrientes), no pudimos identificar ningún mecanismo que pueda facilitar la cooperación directa entre las especies de Listeria y Proteobacteria. Sin embargo, las proteobacterias producen una variedad de policétidos y péptidos no ribosómicos, que pueden inhibir otras bacterias [60] que podrían ser competidoras de Listeria. Curiosamente, también se descubrió anteriormente que las proteobacterias son el filo más abundante en las comunidades bacterianas de los desagües del piso en un ambiente de procesamiento de alimentos contaminado por L. monocytogenes [61]. Además, una gran proporción de especies correlacionadas negativamente con L. monocytogenes se clasificaron en Actinobacteria. De acuerdo con nuestro hallazgo, un estudio previo informó que el exopolisacárido de Bifidobacterium bifidum, una especie de Actinobacteria, mostró actividad antibacteriana contra varias bacterias patógenas, incluida L. monocytogenes [62]. Si bien nuestros hallazgos arrojan luz sobre posibles interacciones de Listeria con otras bacterias en el ambiente del suelo, se limitan a correlaciones a nivel de especie. Se necesitan investigaciones sobre la causalidad de las comunidades microbianas en la adaptación y diversificación genómica de Listeria a un nivel taxonómico/filogenético más detallado (por ejemplo, cepas) para dilucidar mejor los mecanismos detrás de estas interacciones.

Es importante destacar que estos factores abióticos y bióticos asociados con las especies de Listeria pueden actuar como limitaciones externas que limitan la transmisión efectiva y eficiente de Listeria entre entornos naturales y asociados a los alimentos, junto con variaciones genéticas asociadas a la fuente que actúan como limitaciones intrínsecas. Si bien la probabilidad de que Listeria se transmita con frecuencia entre entornos naturales y asociados a alimentos tiende a ser baja, en el linaje I de L. monocytogenes, que causa principalmente infecciones clínicas, detectamos 31 aislamientos de instalaciones de productos agrícolas que estaban estrechamente relacionados con uno o más aislados del suelo. de Nueva York, MD, IA y MN. Para la transmisión de L. monocytogenes a larga distancia desde el suelo hasta las instalaciones de procesamiento de productos, la ruta de transmisión que planteamos como hipótesis es el suelo en el ambiente natural—campos de productos agrícolas adyacentes (p. ej., a través de la deposición de heces de animales salvajes)—contaminación de productos agrícolas—transporte de productos contaminados para producir instalaciones de procesamiento. También es posible que L. monocytogenes se transmita directamente desde el suelo en el entorno natural a las instalaciones de procesamiento de productos agrícolas cercanas debido a actividades humanas (por ejemplo, a través de la suciedad de los zapatos). Nuestros resultados sugieren que la incidencia de la diseminación desde ambientes naturales a ambientes asociados a alimentos no es cero, en concordancia con inferencias previas [63].

En general, a través del análisis genómico comparativo de aislados de Listeria de entornos naturales y asociados a alimentos, detectamos pruebas sólidas de adaptaciones diferenciales en especies de Listeria tanto patógenas como no patógenas. Los factores intrínsecos que subyacen a esta adaptación incluyeron la diversificación de los genomas centrales y la ganancia y pérdida de genes accesorios, particularmente aquellos involucrados en la biogénesis de la envoltura celular y el metabolismo de los carbohidratos, así como plásmidos e islotes de supervivencia al estrés. Con el aprendizaje automático, estas variantes genéticas intrínsecas (p. ej., cgMLST) pueden predecir con precisión las fuentes de aislamiento de Listeria a un nivel taxonómico fino, lo que beneficiará el seguimiento de fuentes de futuros brotes transmitidos por alimentos y la contaminación de alimentos causada por L. monocytogenes. Además, también identificamos una serie de factores extrínsecos, incluidos los parámetros del suelo, el clima y el uso de la tierra, y otras especies bacterianas, particularmente aquellas que representan Proteobacterias y Actinobacterias, que pueden contribuir a las adaptaciones diferenciales en las especies de Listeria. Estos factores intrínsecos y extrínsecos también representan nuevas barreras potenciales que limitan la transmisión de las especies de Listeria, incluido el patógeno alimentario L. monocytogenes, desde entornos naturales a entornos asociados con alimentos, además de las barreras geográficas comúnmente reconocidas.

Los conjuntos de datos utilizados en este estudio incluyen datos de aislamientos recolectados de (i) suelo en el entorno natural de los Estados Unidos, (ii) agua agrícola y (iii) instalaciones de procesamiento de productos agrícolas. Las lecturas sin procesar y los genomas ensamblados para los aislados en los conjuntos (i) y (ii) se han depositado en el SRA y el NCBI DDBJ/ENA/GenBank del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI), respectivamente, con los números de acceso que figuran en la Tabla S1. Debido a la sensibilidad y privacidad de los datos, las lecturas sin procesar y los genomas ensamblados para los aislados en el conjunto (iii) no se cargaron en NCBI; sin embargo, estos datos están disponibles en el repositorio eCommons de la Universidad de Cornell: https://doi.org/10.7298/74sp-fg52. Las lecturas de secuenciación de 16 S rRNA se depositaron en NCBI Sequence Read Archive con el número de acceso PRJNA749132.

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Este trabajo fue apoyado por el Center for Produce Safety (número de premio 2018CPS13) a través del Departamento de Agricultura y Servicios al Consumidor de Florida (bajo el acuerdo número 024842) y la subvención de la Iniciativa de Investigación de Cultivos Especiales (número de premio 2019-51181-30016) del Departamento de EE. UU. de Agricultura – NIFA (MW) y 4-VA (JL). Cualquier opinión, hallazgo, conclusión o recomendación expresada en esta publicación pertenece a los autores y no refleja necesariamente el punto de vista del Center for Produce Safety o del USDA.

Departamento de Ciencias de los Alimentos, Universidad de Cornell, Ithaca, Nueva York, EE. UU.

Jingqiu Liao, Xiaodong Guo, Genevieve Sullivan y Martin Wiedmann

Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental, Virginia Tech, Blacksburg, VA, EE. UU.

Jingqiu Liao

Facultad de Ciencias Biomédicas y Farmacéuticas, Universidad Tecnológica de Guangdong, Guangzhou, Guangdong, China

shaoting li

Departamento de Ciencias de la Computación, Virginia Tech, Blacksburg, VA, EE. UU.

Sai Manohar Balu Anupoju

Departamento de Ciencia y Tecnología de los Alimentos, Virginia Tech, Blacksburg, VA, EE. UU.

Rachel A. Cheng y Daniel L. Weller

Departamento de Bioestadística y Biología Computacional, Centro Médico de la Universidad de Rochester, Rochester, Nueva York, EE. UU.

Daniel L. Weller

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Hai Long Zhang

Centro para la Seguridad Alimentaria, Universidad de Georgia, Griffin, GA, EE. UU.

Xiangyu Deng

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JL y MW diseñaron el estudio. XG realizó los experimentos de laboratorio. JL, SL, BA y HZ analizaron los datos con aportaciones de XD y MW. JL escribió el artículo con aportaciones de RC, GS y MW. DW y GS ayudaron con la adquisición aislada y el acceso a datos.

Correspondencia a Jingqiu Liao.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Liao, J., Guo, X., Li, S. et al. La genómica comparada revela una amplia variación genómica entre poblaciones de especies de Listeria en entornos naturales y asociados a alimentos. COMUN ISME. 3, 85 (2023). https://doi.org/10.1038/s43705-023-00293-x

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Recibido: 12 de abril de 2023

Revisado: 02 de agosto de 2023

Aceptado: 04 de agosto de 2023

Publicado: 19 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s43705-023-00293-x

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